IDT NGS二代測(cè)序微小殘留病灶MRD解決方案

--文庫(kù)構(gòu)建試劑盒、定制化Panel雜交捕獲探針組

北京云肽生物科技代理的IDTNGS二代測(cè)序DNA建庫(kù)試劑盒、定制化Panel(雜交捕獲探針組，為高效進(jìn)行微小殘留病灶(MRD)實(shí)驗(yàn)寬基礎(chǔ)研究握供了理想選擇。

一、背景介紹

微小殘留病灶(minimal residual disease, MRD)或分子殘留病灶(molecular residual disease)，是指癌癥患者經(jīng)過(guò)手術(shù)gen治性治療后，傳統(tǒng)影像學(xué)或?qū)嶒?yàn)室方法不能發(fā)現(xiàn)病灶，但通過(guò)基于二代測(cè)序(NGS)的液體活檢技術(shù)可檢出癌細(xì)胞分子的情況。實(shí)體瘤患者檢出微小殘留病灶MRD代表癌細(xì)胞在體內(nèi)持續(xù)存在，癌癥復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)高。微小殘留病灶MRD在多種實(shí)體瘤中都具有很好的預(yù)后價(jià)值。

2021年初，結(jié)腸癌NCCN2021.V2版指南出爐，在討論部分中新增了對(duì)外周血循環(huán)腫瘤DNA(CtDNA)檢測(cè)的描述。指南引用了三項(xiàng)臨床研究，其均采用了結(jié)合腫瘤組織測(cè)序的ctDNA檢測(cè)方案，論證了ctDNA指導(dǎo)的微小殘留病灶MRD方法提示結(jié)腸癌患者接受治療后復(fù)發(fā)可能的可行性。

目前實(shí)體瘤領(lǐng)域通過(guò)ctDNA檢測(cè)微小殘留病灶MRD的方法主要有兩類，分別是基于血漿檢測(cè)的tumor-agnostic方案(使用固定panel進(jìn)行多位點(diǎn)覆蓋的ctDNA檢測(cè))和基于組織先驗(yàn)的tumor-informed方案(先對(duì)組織進(jìn)行WES全外顯子測(cè)序以獲得信息，再個(gè)性化定制panel進(jìn)行ctDNA超深度測(cè)序)。不同實(shí)體瘤的個(gè)體化差異巨大，panel的設(shè)計(jì)需要深思熟慮;早期實(shí)體瘤釋放到外周血中的cDNA量非常少，對(duì)檢測(cè)靈敏度要求非常高;ctDNA檢測(cè)作為病程管理的一部分，檢測(cè)的可重復(fù)性同樣至關(guān)重要;這些因素對(duì)微小殘留病灶MRD檢測(cè)在實(shí)體瘤中的應(yīng)用帶來(lái)了巨大的挑戰(zhàn)。

二、IDT NGS二代測(cè)序解決方案

IDT可以提供豐富的產(chǎn)品組合，滿足從游離DNA樣本文庫(kù)構(gòu)建到靶向捕獲的全套需求。

1、IDT xGen CfDNA&FFPE DNA文庫(kù)制備試劑盒

IDT xGen CDNA&FFPE DNA文庫(kù)制備試劑盒，支持對(duì)微量DNA樣本進(jìn)行靈敏且準(zhǔn)確的變異檢測(cè)。通過(guò)兩步連接法，可在獲得理想文庫(kù)轉(zhuǎn)化率的同時(shí)，抑制接頭二聚體的形成。在單鏈連接的過(guò)程中，可引入特異性的分子標(biāo)簽(UMI)序列，以適配多種去重和錯(cuò)誤校正的方法。現(xiàn)用低品質(zhì)樣本建立高品質(zhì)文庫(kù)，助力微小殘留病灶MRD研究。

優(yōu)勢(shì)

①為困難樣本量身打造，更大化數(shù)據(jù)輸出;

②提升樣本轉(zhuǎn)化率，達(dá)到更高的文庫(kù)復(fù)雜度;

③結(jié)合UMI糾錯(cuò)處理，實(shí)現(xiàn)低頻突變的檢測(cè)。

圖.IDT xGen  cfDNA&FFPE DNA文庫(kù)制備試劑盒提供了非常高的轉(zhuǎn)化率和文庫(kù)復(fù)雜度，從而在目標(biāo)區(qū)域獲得更好的覆蓋深度。使用10ng的cfDNA標(biāo)準(zhǔn)品并按照IDT提供的標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行文庫(kù)制備，并用覆蓋16Kb的定制IDT xGen Custom Hyb Panels-Production 探針對(duì)文庫(kù)進(jìn)行靶向捕獲。將捕獲后的文庫(kù)混合起來(lái)并在IIIumina Nextseq550測(cè)序儀上進(jìn)行測(cè)序。采用BWA(0.7.15)對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)講行比對(duì)，并用Picard(2.18.9)進(jìn)行覆蓋深度和復(fù)雜度(評(píng)估單一分子數(shù)，使用參數(shù)為HS文庫(kù)大小)的計(jì)算。

圖.IDT xGED cfDNA&FFPE DNA文庫(kù)制備試劑盒提高對(duì)低頻突變的檢測(cè)靈敏度和特異性。使用25ng的cfDNA標(biāo)準(zhǔn)品按照IDT提供的標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行文庫(kù)制備，標(biāo)準(zhǔn)品中突變基因的頻率(MAF)為0.25%。使用61kb的定制IDT xGen Custom Hyb Panels-Production探針進(jìn)行文庫(kù)捕獲，在測(cè)序后使用BWA(0.7.15)進(jìn)行比對(duì)并按照IDT xGen cfDNA&FFPE試劑盒分析指南所述進(jìn)行start-stop去重，或者按照combined read families的方法進(jìn)行去重和錯(cuò)誤校正。最后使用VarDict(1.5.8)識(shí)別變異。PPV=陽(yáng)性預(yù)測(cè)值，足衡量突變檢出準(zhǔn)確度的指標(biāo)。

2、IDT xGen Custom Hyb Panels-Production 探針庫(kù)

DTxGen custom HvbPanels-Producion探針是帶有5端生物素標(biāo)記的DNA探針，每一條探針均經(jīng)過(guò)單獨(dú)合成、單獨(dú)質(zhì)檢，可用于NGS二代測(cè)序中對(duì)目標(biāo)序列進(jìn)行富集。實(shí)驗(yàn)證明，與通過(guò)微陣列合成的捕獲探針相比，IDT xGen Custom Hyb Panels-Production探針實(shí)現(xiàn)的捕獲均一性更高，GC偏好性更少，能夠以更少的測(cè)序次數(shù)獲得更佳的測(cè)序深度。lDTxGen Custom Hyb Panels-Production探針庫(kù)可用模塊化的方式進(jìn)行制備和使用，既可以獨(dú)立使用，也可以通過(guò)spike-in panel的形式與現(xiàn)有的探針庫(kù)結(jié)合使用，具有非常高的靈活性，是品質(zhì)穩(wěn)定、性能優(yōu)異的捕獲探針選擇。

優(yōu)勢(shì)

①單獨(dú)合成、單獨(dú)質(zhì)控的探針，實(shí)現(xiàn)高效均一的目標(biāo)富集:

②模塊化設(shè)計(jì)，實(shí)現(xiàn)經(jīng)濟(jì)高效的定制和簡(jiǎn)單輕松的目標(biāo)點(diǎn)擴(kuò)充:

③嚴(yán)格質(zhì)控，降低批次間差異。

圖3.使用IDT的探針庫(kù)實(shí)現(xiàn)高度均一的目標(biāo)區(qū)域覆蓋。針對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品基因組DNA(Coriell)構(gòu)建文庫(kù)，使用lDT xGen Custom Hyo Panels-Production 探針庫(kù)進(jìn)行捕獲反應(yīng)(目標(biāo)區(qū)域?yàn)?8kb)。富集后的文庫(kù)在!uminaNextseq測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序，對(duì)600K reads進(jìn)行生信分析。結(jié)果顯示，(A)單次測(cè)序的覆蓋均一度較高;(B)同一個(gè)探針庫(kù)的兩個(gè)不同批次，顯示出較高的一致性。

三、成功案例

重慶lu軍軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院余佩武教授團(tuán)隊(duì)，研究了基于ctDNA檢測(cè)的微小殘留病灶MRD水平與胃癌術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)之間的聯(lián)系，其研究成果論證了cDNA作為新興的生物標(biāo)志物在胃癌療效檢測(cè)和預(yù)后評(píng)估中的臨床意義。該研究中使用的定制捕獲panel采購(gòu)自IDT。

圖。圖中顯示了影像學(xué)結(jié)果，ctDNA水平與腫瘤標(biāo)志物CEA在術(shù)后的動(dòng)態(tài)變化，提示了ctDNA檢測(cè)在胃癌病人術(shù)后檢測(cè)中的潛在應(yīng)用價(jià)值。

IDT為NGS靶向捕獲實(shí)驗(yàn)提供端到端的產(chǎn)品覆蓋，并在精準(zhǔn)性、經(jīng)濟(jì)性和穩(wěn)定性這三個(gè)方面具有顯著優(yōu)勢(shì)。

①精確性:IDT埃豐富的UMI接頭選擇，結(jié)合以IDT xGen cfDNA&FFPE DNA文庫(kù)制備試劑盒為代表的新穎的建庫(kù)方法，可大大提高樣本轉(zhuǎn)化率和檢測(cè)靈敏度;高質(zhì)量的探針合成為高效檢測(cè)體細(xì)胞突變和甲基化水平打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，助力ctDNA的多維度研究。

②經(jīng)濟(jì)性:IDT  xGen Custom Hyb Panels-Accel探針庫(kù)進(jìn)一步降低使用門(mén)檻，加快探針交付速度，讓新項(xiàng)目快人一步。

③穩(wěn)定性:超過(guò)30年的寡核苷酸合成經(jīng)驗(yàn)，結(jié)合獨(dú)特的化學(xué)合成工藝和嚴(yán)格的質(zhì)控方法，使IDT xGen Custom Hyb Panels-Production探針組的表現(xiàn)穩(wěn)定。

四、IDT微小殘留病灶MRD相關(guān)產(chǎn)品